窖泥中产酸功能菌筛选及发酵条件初探

 王耀1，李喆1 ，甘广东1，姜雷1 ，杨勇1 ，沈晓波1，刘志刚2 ，房晓辉2

（1.江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏宿迁223800;2.江南大学生物工程学院，江苏，无锡214000）

摘要:从洋河酒厂优质老窖泥中分离纯化筛选出一株产己酸的芽孢杆菌YHY03，经生理生化分析初步鉴定为克氏梭状芽孢杆菌。通过正交优化获得最优发酵培养基，并对YHY03发酵产酸代谢过程进行研究。实验结果表明：其发酵改良培养基的物质最优配比为：1.5%蔗糖；2%乙醇；0.5%乙酸钠，0.1%酵母膏、0.04%磷酸氢二钾、0.05%硫酸铵、0.02%硫酸镁。优化后己酸产量为285.32mg/100mL，己酸产量提高比例为148.2%，优化效果较明显。该菌株代谢产生己酸主要通过两个途径：0 至4天直接利用乙酸合成，同时积累丁酸；6 至12天利用丁酸反应形成己酸。

关键词：己酸；窖泥；纯化；正交优化

中图分类号：TS262.3；TS261.13;TS261.15;TS261.4 文献标识码：B

 

0 引言

己酸菌是一类能发酵产生己酸的厌氧芽孢细

菌，是浓香型白酒生产中最重要的窖泥功能菌，其

代谢产物己酸，是浓香型白酒的主体酸之一[1]。己酸

在白酒中起到呈香、助香、减少酒体刺激以及缓冲

平衡的作用[2]，并且己酸是浓香型白酒主体香气成

分己酸乙酯的前体。生产上，通过扩大培养生产以

己酸菌为主的窖泥功能菌液，用于人工窖泥生产以

及窖池保养，改善窖池生态环境，提高基酒质量。也

有通过发酵培养己酸菌，产生以己酸为主体的风味

有机酸，作为调味酸，改善浓香型白酒的风味及口

感。老窖泥由于长期生产，富集筛选了丰富的包括己

酸菌在内的有益酿酒微生物。本实验从优质老窖泥

中分离、纯化出一株高产己酸的功能细菌，并对其发

酵条件进行优化，并分析产酸代谢情况，以期为改善

窖内微生态环境、提高浓香型白酒质量提供参考。

 

1 材料与方法

1.1 实验材料

窖泥样品：取自江苏洋河酒厂股份有限公司老

窖池窖泥

实验药品：酵母膏，乙酸钠，蛋白胨，葡萄糖，碳

酸钙，无水酒精，生物素，对氨基苯甲酸，硫酸镁，磷

酸二氢钾

实验设备：旋转蒸发器，恒温培养箱，离心机，

分光光度计，气相色谱仪，厌氧培养箱

1.2 实验方法

1.2.1 实验流程[3,4]

窖泥取样→预处理→富集培养→己酸定性分

析→平板分离纯化→发酵代谢产物分析→生理生

化分析→单因素实验→正交试验→验证实验→发

酵过程分析

1.2.2 窖泥预处理[5]

灭菌后的20 支装有每支15~20mL 富集培养基

的试管里分别加入1g窖泥，玻璃棒捣碎搅匀，85℃

水浴锅加热10min。

1.2.3 己酸定性分析—CuSO4显色法定性分析

取培养后样品上层清液2mL，加2%硫酸铜溶

液2mL，乙醚1mL，振荡，使之反应分层。观察乙醚

层呈现的绿色并记录，颜色越深，则己酸含量越高。

1.2.4 发酵代谢产物—气相色谱分析[6]

取上清液浓硫酸调节pH至2~3，过0.42μm 滤

膜，直接进样色谱分析。GC 条件：柱子型号是

CP-WAX 57CB(规格50m 长，内径0.25mm，膜厚

0.2mm)；初温35℃，保持6min，再以4℃/min 升温至

75℃，保持10min，再以25℃/min 升温至175℃，保

持2min，最后以10℃/min 升温至215℃，保持

24min。分流比为35∶1，进样量为1μL，载气为N2。

内标共3 个，分别是叔戊醇、乙酸正戊酯和2- 乙

基正丁醇。

1.2.5 菌种的初步鉴定[7]

①革兰氏染色：从斜面上挑取少许菌苔，涂布

在干净玻片上的无菌水中，风干固定，初染、媒染与

复染，镜检。

②糖类发酵：乙酸钠0.5%、酵母膏0.1%、磷酸

氢二钾0.04%、硫酸铵0.05%、硫酸镁0.02%，分别

添加1%葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉，pH6.8~7.2，10%

接种、34℃发酵，观察发酵状态，分析代谢产物。

③明胶水解：蛋白胨0.5%、明胶15%、pH7.0 装

大试管，20℃培养，观察表面有无凹陷现象。

④甲基红试验、V.P 试验、硝酸盐还原试验、产

硫化氢试验、接触酶实验：参照常见细菌鉴定手册。

1.2.6 正交优化实验

通过单因素实验确定因素水平，采用L9 （34）正

交设计表进行实验设计，运用Minitab 软件对所得

结果进行结果分析，得出最优水平组合。

1.2.7 发酵罐培养

采用优化后培养基，10%接种量，37℃培养，每

隔2天取样进行镜检及代谢产物分析。

2 结果分析

2.1 己酸菌分离纯化结果分析

取富集培养后发酵液进行CuSO4 显色定性分

析，挑选出颜色深的发酵样品。经多次平板分离纯

化，分离出6株菌。分别以6 株菌株作为菌种进行发

酵，对发酵液进行色谱分析，所得结果如表1 所示。

由表1 可知，1、2、3、4、5 号菌株己酸产量低，不

作为目标菌株。6 号YHY03 菌发酵后己酸产量较

高，达到104.95mg/100mL，表明该菌株代谢产生己

酸能力强，作为目标菌株。

 

2.2 生理生化特性分析

对菌株YHY03 进行生理生化特性分析，所得

结果如表2 所示。

菌株YHY03 菌落形态及镜检形态如图1 及2

所示。

依据菌株形态、代谢产物分析及生理生化特性

分析结果，对照“伯杰氏细菌鉴定手册”，初步鉴定

菌株YHY03 为克氏梭状芽孢杆菌。

2.3 发酵条件优化

2.3.1 不同糖类物质对己酸产量的影响

在巴氏培养基基础上，分别添加不同糖类进行

发酵培养，气相色谱分析代谢产物结果如表3 所示。

在巴氏培养基基础上增加糖类，能够为菌株提

供一定额外的碳源，对代谢方向可能有一定的影

响。由图3可知，当培养基加入葡萄糖为底物时，发

酵呈现明显抑制菌体代谢产己酸，代谢朝生成乙酸

方向；而培养基加入蔗糖、乳糖、淀粉均能提高己酸

产量，尤其以培养基中添加蔗糖具有最大的己酸产

量，达到151.03mg/100mL，推测蔗糖对于菌体代谢

产生己酸具有最强促进作用。

2.3.2 单因素实验结果

2.3.2.1 蔗糖添加量为变量的培养基对己酸产量的

影响

对添加不同蔗糖量的培养基发酵后产物进行气

相色谱分析，所得结果如图4 所示。

由图4 可知，己酸产量随着蔗糖添加量的增加

呈上升状态，当蔗糖添加量达到2%后继续添加则

己酸产量又呈下降趋势，整体呈现出先增后减的态

势。添加2%的蔗糖时，己酸产量达到峰值

195.03mg/100mL。

2.3.2.2 乙醇添加量为变量的培养基对己酸产量的

影响

对不同乙醇添加量的培养基发酵后产物进行

气相色谱分析，所得结果如图5 所示。

由图5 可知，己酸产量随着培养基中乙醇添加

量的增加呈上升状态，当乙醇添加量达到2%后继

续添加则己酸产量又呈下降趋势，整体呈现出先增

后减的态势。当培养基中添加2%的乙醇时，己酸产

量达到峰值259.09mg/100mL，随后随添加量增加己

酸产量逐渐降低。

2.3.2.3 乙酸钠添加量为变量的培养基对己酸产量

的影响对添加不同乙酸钠的培养基发酵后产物对进行气

相色谱分析，所得结果如图6 所示。

由图6 可知，己酸产量随着培养基中乙酸钠添

加量的增加呈下降趋势。在所选的几个梯度中，当

培养基中添加0.5%的乙酸钠时达到最大的己酸产

量。

2.3.3 正交优化结果

依据优化培养基目的是为了使代谢偏向高产

己酸，因此以己酸产量作为培养基优化的依据。通

过单因素实验分别确定了单因素条件下蔗糖、乙醇

以及乙酸钠的最优条件所在水平区间，分别选取三

个水平。以蔗糖、乙醇以及乙酸钠作为因素，己酸产

量为优化依据，按照L9（34）设计表进行优化，考察不

同培养基组分对代谢产己酸的影响。各因素水平表

见表3。

依照正交设计表进行实验，对实验结果进行正

交分析，所得结果如表4、图7 所示。

对上述正交实验结果分析得，极差R 值

RA>RC>RB，分析得各因素对YHY03 代谢产生己

酸的影响程度由大到小依次为：蔗糖> 乙酸钠> 乙

醇。结合主效应图分析得，最佳水平为A1B3C2，即

发酵改良培养基的物质最优配比为：1.5%蔗糖；2%

乙醇；0.5%乙酸钠。

对上述最优配比结果进行验证实验，所得己酸

产量为285.32mg/100mL，对比正交实验结果具备最

大的产酸量，故正交实验结果验证成功，正交实验

所得结果为最优方案。因此，YHY03 代谢产生己酸

的最优培养基组成为：1.5%蔗糖；2%乙醇；0.5%乙

酸钠、0.1%酵母膏、0.04%磷酸氢二钾、0.05%硫酸

铵、0.02%硫酸镁。

2.4 发酵代谢动态变化过程

2.4.1 生长曲线测定

以5L 发酵罐为发酵容器，采用改良后的培养

基，10%接种量进行小罐培养实验，每两天对发酵过

程进行取样分析，所得结果如表5 所示。

由表5 和图8 可知，YHY03（J）发酵过程中总菌

数呈现典型的S 型生长曲线。发酵过程中菌体数目

呈现先增长后下降趋势，第4 至6 天增长速率最

高，推测为分裂期。第8 天出现最高菌数，达到

9.3×107个/mL，随着发酵时间延长，总菌数下降，芽

孢增多，推测后期由于代谢产物产物积累抑制菌体

代谢，菌体开始逐步走向衰亡期，数目下降。发酵过

程中pH 逐渐降低，前期快速下降，后期由于CaCO3

的缓冲作用，使得pH稳定在6.2 左右。

2.4.2 产酸代谢分析

在发酵过程中，进行取样，对样品进行酸化处

理并过滤，直接进样进行色谱分析。气相色谱分析

结果如图所示。

由图9 可知，发酵过程中乙醇含量逐渐被消

耗，6 天前乙醇消耗速率较低，6 天后乙醇消耗速率

提高。依据物质含量变化，可将代谢过程分为三个

时期。0 至2天，主要代谢产生乙酸，乙酸含量增加

明显。2 至4 天，主要为乙酸代谢生成丁酸和己酸，

乙酸含量迅速降低，而己酸和丁酸含量迅速增加，

并且增长速率接近，说明此阶段直接利用乙酸合成

丁酸和己酸。4 至12 天，主要为丁酸代谢产生己酸，

乙醇消耗速率提高，直至丁酸被消耗，己酸含量稳

定。由图可知，该菌株代谢产生己酸主要通过两个

途径：直接利用乙酸合成；先合成丁酸再利用丁酸

反应形成己酸。随着发酵时间延长，己酸略有下降，

丁酸和乙酸略有回升，最终发酵后期达到动态平

衡。

3 结论

3.1 本实验从老窖泥中筛选出一株高产己酸菌株

YHY03，初步鉴定菌株为克氏梭状芽孢杆菌。该菌

株产己酸能力强，发酵过程中具有典型的生长曲

线。

3.2 本实验以巴氏培养基为基础，以己酸产量为依

据，通过L9（34）正交优化表优化，最终确定YHY03

发酵改良培养基的物质最优配比为：1.5%蔗糖；2%

乙醇；0.5%乙酸钠、0.1%酵母膏、0.04%磷酸氢二钾、

0.05%硫酸铵、0.02%硫酸镁。优化后己酸产量为

285.32mg/100mL，较最初的传统巴氏培养基己酸产

量提高了170.37mg/100mL，提高比例为148.2%，优

化效果较明显。

3.3 通过发酵代谢动态变化过程分析可知，YHY03

菌株在0 至6 天主要完成菌体分裂以及己酸代谢

前提物质积累，己酸生成主要通过乙酸直接合成途

径。6天后开始利用丁酸大量合成己酸，发酵10 天

己酸含量达到最高。

[参考文献]

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